低剂量还原型谷胱甘肽可促进人脐血干细胞增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.01.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：获得足够数量的细胞是细胞移植治疗中面临的一个关键问题，有研究表明可以通过合理的刺激促进干细胞增殖。
目的：观察还原型谷胱甘肽对人脐血间充质干细胞的生物学特性的影响。
方法：实验分为两组，对照组为正常人脐血间充质干细胞，实验组为使用0.15 g/L质量浓度的还原型谷胱甘肽处理的人脐血间充质干细胞。
结果与结论：MTT实验结果显示，干预后第5，7，9天，实验组细胞的吸光度值明显高于对照组(P < 0.05)。流式细胞术显示，实验组还原型谷胱甘肽对人脐血间充质干细胞的表面标志分子CD29\CD44\CD45\CD105的表达无影响。实时PCR结果显示，还原型谷胱甘肽可以促进人脐血间充质干细胞中细胞外信号调节激酶mRNA的表达(P < 0.05)。结果证实，质量浓度0.15 g/L的还原型谷胱甘肽可促进人脐血干细胞增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脐血干细胞, 还原型谷胱甘肽, 脐血间充质干细胞, 增殖, MTT, 流式细胞术, 细胞外信号调节激酶, Real-time PCR, 表面标志物

Abstract:

BACKGROUND: How to obtain a sufficient number of cells is one of the key issues in the cell transplantation therapy, and studies have shown that stem cell proliferation can be promoted by reasonable stimulus.
OBJECTIVE: To investigate reduced glutathione effects on biological characteristics of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells.
METHODS: The cells were divided into two groups: the control group consisted of the normal human umbilical cord blood mesenchymal stem cells, and in the experimental group, human umbilical cord blood mesenchymal stem cells were treated with 0.15 g/L reduced glutathione.
RESULTS AND CONCLUSION: At days 5, 7, 9, cells treated with 0.15 g/L reduced glutathione showed higher absorbance values than those in the control group (P < 0.05). Flow cytometry showed reduced glutathione had no effects on CD29, CD44, CD45, CD105 expression. Real-time PCR results showed reduced glutathione was capable of promoting extracellular signal-regulated kinase mRNA expression (P < 0.05). Findings from this study showed that 0.15 g/L reduced glutathione can promote the proliferation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells.

Key words: stem cells, umbilical cord, mesenchymal stem cells, glutathione

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

2.1 人脐血间充质干细胞的鉴定结果 见图1。培养5 d时，细胞贴壁呈梭形，有些细胞排列呈鱼贯状相连，部分细胞的胞体中央略膨大(图1F)。培养9 d时，细胞铺满培养瓶的底面，贴壁细胞为成纤维细胞样，呈漩涡状生长，中心细胞为复层生长，大部分细胞胞体呈单层漩涡状或辐射状(图1G)。流式细胞仪检测示CD29\CD44\CD45\CD1055阳性，细胞均一性好，纯度达96%以上。

2.2 流式细胞术检测人脐血间充质干细胞的表面标志物的表达 见表1。

取P3代的人脐血间充质干细胞通过流式细胞术检测使用还原型谷光甘肽处理过的间充质干细胞的表面标志物CD29\CD44\CD45\CD105的表达，结果显示实验组细胞与对照组细胞的表面标志分子的表达阳性率差异无显著性意义(P > 0.05)，提示还原型谷光甘肽对脐血间质干细胞的表面标志物的表达无影响。

2.3 还原型谷光甘肽对人脐血间充质干细胞的增殖能力的影响 实验用MTT法检测还原型谷光甘肽对人脐血间充质干细胞的增殖能力的影响，在加入质量浓度0.15 g/L的还原型谷光甘肽处理后第 1，3，5，7，9天的吸光度值，用以反映细胞的数目，结果显示实验组细胞在第1，3天与对照组差异无显著性意义，第5，7，9天实验组细胞的吸光度值明显高于对照组(P < 0.05)，提示人脐血间充质干细胞经过还原型谷光甘肽处理增殖能力增强，见表2。

2.4 Real time PCR检测人脐血间充质干细胞中细胞外信号调节激酶mRNA的水平 Real time PCR检测各目的基因的扩增过程(半对数图谱)，和熔解曲线：细胞外信号调节激酶mRNA扩增过程(半对数图谱)，熔解曲线；GADPH mRNA扩增过程(半对数图谱)，熔解曲线。采用脐带间质干细胞自身作对照，观察加入还原型谷光甘肽后细胞细胞外信号调节激酶mRNA水平的变化，从图中可以看出细胞外信号调节激酶的量随着时间的延长是存在变化的，随着干预时间的延长，细胞外信号调节激酶 mRNA的水平逐渐增高(P < 0.05)(图1)。

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引言

人脐血间充质干细胞是一种具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，其来源于中胚层，可分化为中胚层的骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等，同时还可以跨胚层分化为心肌细胞和神经元等^[1]，

脐血间充质干细胞具有数量丰富、繁殖力强、安全可靠、免疫原性低、治疗疾病种类多等优点，并且取材方便，其采集对母亲和胎儿没有任何的不良反应，因此脐带间充质干细胞优于骨髓间充质干细胞，成为细胞工程更好的研究对象。目前关于脐血间充质干细胞的研究主要集中在应用方面，很多研究表明脐带间充质干细胞在很多疾病中显示了良好的治疗效果，Yuan等^[2]采用SD大鼠做肾缺血再灌注损伤模型，采用肝细胞生长因子修饰的脐带间质干细胞治疗大鼠损伤，采用颈静脉进行细胞移植，明显降低模型大鼠的肌酐及尿素的水平。Wu等^[3]采用SD大鼠制作心肌梗死模型，模型建立成功后注射脐带间充质干细胞进行治疗，超声心动检测可以明显改善心脏功能。刘安等^[4]将脐血间充质干细胞应用与大鼠脑出血模型，可以明显增加髓鞘碱性蛋白的表达，改善神经功能，另外有文献报道将脐带间充质干细胞应用于系统性红斑狼疮等免疫性疾病模型，治疗效果良好^[5]。

脐带间充质干细胞的分离方法主要是通过组织块贴壁培养法和消化培养法，无论哪种方法都可以成功的分离脐带干细胞，然后在体外进行扩增培养，但是实验在多年的间质干细胞研究过程中注意到一个关键性的实际问题，即人间质干细胞在体外培养时其扩增代数有限，分离培养几代后人间质干细胞即趋于老化而停止增殖，这种现象对于干细胞移植来说极大的限制了其临床应用，由于每次从脐带分离的间质干细胞的数目是有限的，主要是通过体外传代培养才能得到足够多数目的细胞用于移植，因此寻找延缓脐血间充质干细胞老化并且促进其增殖的方法对于间质干细胞应用于临床治疗具有重要作用。

还原型谷光甘肽是细胞内的抗氧化剂，巯基是还原型谷光甘肽最重要的功能集团，通过直接作用和参与某些抗氧化酶的酶促反应^[6]，协调内源性与外源性抗氧化剂的作用，维持自由基的产生和清除，保护细胞免受氧化损伤，并使内环境处于稳定的还原态。很多研究表明还原型谷光甘肽在体内具有较好的抗自由基抗氧化作用，可以延缓细胞衰老，细胞内外的还原型谷光甘肽水平与细胞的生长速度有着一定的相关性。有研究发现在一浓度范围内，还原型谷光甘肽可促进肝细胞增殖^[7]；生长迅速的肿瘤细胞对还原型谷光甘肽的需求量显著增加^[8]，但使用外源性合成的药物处理细胞对脐血间充质干细胞的生物学特性及对其增殖的影响还不是很清楚。

因此，实验拟观察还原型谷胱甘肽对人脐血间充质干细胞表面标记及增殖的影响，为其临床应用的可行性提供依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：于2010年1月至2012年3月在天津市第四中心医院细胞验室完成。

材料：

人脐血标本：所有标本来源于本院产科当日剖宫产健康婴儿的新鲜脐带，长3-5 cm，胎龄39-40周，无各种先天性疾病；产妇体健，无肝炎、梅毒、艾滋病等传染性疾病，产妇及家属对脐带用于实验研究均知情同意。

根据中华人民共和国国务院颁发的《医疗机构管理条例》^[9]，在实验前将实验方案和风险告知对方，并签署知情同意书。

方法：

人脐血间充质干细胞的培养：取新鲜无菌的脐带组织，先用无菌PBS冲洗，去掉残存血迹，再用含抗生素(含青霉素、链霉素)的PBS浸泡10 min，剔除脐带中的血管，将剩余的组织剪碎至1 mm³大小的组织块，将组织块接种于体积分数10%FBS的培养液中，置于37 ℃，体积分数5% CO₂的培养箱中培养，贴壁细胞即为间质干细胞，至细胞浓度至70%融合，使用胰酶消化，以1×10⁵的细胞个数接种于细胞培养瓶中进行传代培养。

流式细胞仪检测还原型谷光甘肽对人脐血间充质干细胞的表面标志的影响：待P2代的人脐血间充质干细胞浓度约70%，用体积分数0.25%的胰酶消化，传至两个培养瓶，其中一瓶正常培养作为对照，另一瓶加质量浓度0.15 g/L 还原型谷光甘肽于细胞培养液中设为实验组，次日胰酶消化细胞，使用CD29\CD44\CD45\CD105标记细胞，经流式细胞仪检测，每种表面标记物的表达情况通过阳性细胞占检测细胞的百分率表示，实验重复3次。

MTT检测还原型谷光甘肽对人脐血间充质干细胞增殖能力的影响：取对数生长期的人脐血间充质干细胞，体积分数0.25%胰酶消化后，用体积分数10%%FBS的DMEM营养液配成细胞悬液，接种于96孔板(1×10³/孔)，每孔再加入100 μL营养液，置于37 ℃体积分数5%CO₂培养箱中培养过夜后，换用含体积分数2%FBS的DMEM营养液继续培养24 h后，加入质量浓度0.15 g/L的还原型谷光甘肽，继续培养24 h后每孔加入20 μL MTT。置于37 ℃体积分数5%CO₂培养箱。培养4 h后，弃上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，振荡器上振荡10 min，酶标仪上检测其在 570 nm处的吸光度值，实验重复5次。

Real time PCR检测还原型谷光甘肽对人脐血间充质干细胞细胞外信号调节激酶 mRNA的表达的影响：待P2代的人脐血间充质干细胞长置70%左右，用体积分数0.25%的胰酶消化，传至两个培养瓶，其中一瓶正常培养作为对照，另一瓶加质量浓度0.15 g/L还原型谷光甘肽于细胞培养液中，次日按照RNA提取试剂盒的说明书提取细胞总RNA，反转录为cDNA，通过Real-time PCR检测细胞细胞外信号调节激酶 mRNA的表达水平，以GADPH为内参。

反应条件：4 ℃预变性2 min；94 ℃ 15 s，64 ℃ 40 s，40次循环，细胞外信号调节激酶mRNA的相对表达量使用细胞外信号调节激酶/GAPDH吸光度比值表示。

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讨论

间充质干细胞是一种很有潜力的组织工程细胞，间充质干细胞是一种来源于组织的干细胞，其可以来源于多种组织，目前主要有骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和脐血间充质干细胞，间充质干细胞由组织分离后可以在体外大量的繁殖并且可以在特定的情况下诱导为多种细胞，而且由于其具有免疫调节的优势，并且不受伦理的限制因此是组织工程和再生医学的具有广泛前景的种子细胞^[10-16]。作者的实验中使用的是脐血间充质干细胞，是从刚出生的胎儿的脐带分离，因此在很大的程度上可以避免受到病毒和后天疾病的影响。

还原型谷胱甘肽在体内具有抗氧化作用。还原型谷胱甘肽在体内具有较好的抗自由基抗氧化作用，可以延缓细胞衰老。细胞内外的还原型谷胱甘肽水平与细胞的生长速度有着一定的相关性。还原型谷胱甘肽可在非酶反应中通过巯基与体内羟自由基(-OH)等活性氧直接反应，转化成易代谢的酸类物质，从而将其清除^[17-19]。在酶促反应的过程中，还原型谷胱甘肽在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下，被还原成氧化性的谷胱甘肽，继而又被还原为还原型谷胱甘肽，发挥抗氧化的作用，另外，还原型谷胱甘肽还可以通过转硫酶的作用于亲电子化合物结合^[20-25]，从而发挥解毒抗氧化的作用。还原型谷胱甘肽降解之后会产生很多的甘氨酸，甘氨酸可以稳定细胞膜，因此外源的还原型谷胱甘肽也可以维持生物膜的完整性，稳定膜蛋白，减轻细胞损伤，促进修复。因此细胞内还原型谷光甘肽含量的改变，可反映机体的抗氧化能力及细胞的氧化应激状态^[26-30]。

很多研究显示还原型谷胱甘肽具有促进细胞增殖的作用，有报道还原型谷胱甘肽可以促进肝细胞增殖，并且生长迅速的肿瘤细胞对还原型谷胱甘肽的需求量显著增明显增加，为了验证还原型谷胱甘肽对于人脐血间充质干细胞的增殖能力的影响，实验使用了MTT实验进行检测，结果发现在对人脐血间充质干细胞使用还原型谷光甘肽进行处理之后，第1，3天实验组和对照组的细胞数量没有明显的差别，第5，7，9天实验组细胞的增殖能力明显高于对照组，提示还原型谷光甘肽对人脐血间充质干细胞的增殖具有促进作用。

在还原型谷光甘肽促进人脐血间充质干细胞增殖的前提下是否会影响间充质干细胞的生物学性能，实验使用了CD29\CD44\CD45\CD105作为检测指标，观察在还原型谷光甘肽处理之后人脐血间充质干细胞的变化，结果发现实验组和对照组两组细胞的CD29\CD44\CD45\CD105表达无明显差异，提示还原型谷光甘肽对人脐血间充质干细胞生物学标志无影响。

为找到还原型谷光甘肽促进人脐血间充质干细胞增殖的原因，实验检测了细胞增殖相关基因细胞外信号调节激酶的表达，结果显示以脐带间质干细胞自身作对照，观察加入还原型谷光甘肽后细胞细胞外信号调节激酶mRNA水平的变化，而且细胞外信号调节激酶的量随着时间的延长是存在变化的，随着时间的延长，细胞外信号调节激酶mRNA的水平逐渐增高。

综上所述，在不影响人脐血间充质干细胞生物学标志物表达的情况下，加入低量的还原型谷光甘肽能明显的增加人脐血间充质干细胞的增殖能力，因此未来可以在体外提高人脐血间充质干细胞的增殖速度减缓细胞衰老，为复杂疾病的干细胞治疗提供足量细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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